BEH 111 و تعیین ویژگی های آنزیم آلفا-آمیالز تولید شده بوسیله این باکتری

Transcript

1 مجله تازه هاي بیوتکنولوژی سلولي- مولكولي دوره دوم شماره هفتم تابستان 1391 بررسی پروفیل آنزیمی باکتری باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 و تعیین ویژگی های آنزیم آلفا-آمیالز تولید شده بوسیله این باکتری 3 الهام آریاپور 1 پروین شریعتی *2 فاطمه تابنده 2 باقر يخچالي 1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسالمی واحد فالورجان اصفهان ایران 2 استادیار گروه زيست فناوري صنعت و محيط زيست پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري )NIGEB( تهران ايران 3 دانشيار گروه زيست فناوري صنعت و محيط زيست پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري )NIGEB( تهران ايران چکیده سابقه و هدف: آمیالزها یکی از آنزیم های عمده صنعتی هستند که حدود 25% از بازار جهانی آنزیم ها را به خود اختصاص می دهند. این آنزیم ها در صنایع مختلف مثل نساجی کاغذ سازی داروسازی و صنایع غذایی مانند شیرین سازی و فرآوری نشاسته استفاده می شوند. تحقیقات بسیاری در ارتباط با کاربرد آنزیم های آمیلولیتیک تولید شده توسط اعضاء جنس باسیلوس در زمینه های مهم تولید قند آبجو صنایع غذایی شوینده ها انجام شده است. گستردگی کاربرد آنزیم هاي آمیلولیتیک موجب می شود که تحقیقات برای مشخص شدن ویژگی های آنزیم ها ادامه داشته باشد. به همین دلیل در این پژوهش بررسی روی پروفیل آنزیمی آمیلولیتیک باکتری بومی و تعیین ویژگی های آن انجام شد. مواد و روش ها: در این مطالعه پروفیل آنزیمی باکتری باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 با استفاده از روش های SDS PAGE زایموگرام و TLC تعیین شد. وزن مولکولی آلفا-آمیالز با استفاده از روش SDS PAGE تخمین زده شد. جهت سنجش کمی فعالیت آنزیم α -آمیالز از معرف دی نیتروسالیسیلیک اسید )DNS( استفاده شد. بررسی ویژگی های آنزيم جهت تايين بیشیته فعالیت آنزيم با روش DNS در شرايط مختلف دما ph غلظت سوبسترا )نشاسته( و زمان اجرا شد. يافته ها: وزن مولکولی آلفا-آمیالز با استفاده از روش 55 PAGE SDS کیلودالتون تخمین زده شد. جهت سنجش کمی فعالیت آنزیم باشد. α -آمیالز از معرف دی نیتروسالیسیلیک اسید )DNS( استفاده شد. بررسی ویژگی های آنزیم نشان داد که بیشیته فعالیت این آنزیم در 50 درجه سانتی گراد ph 7 در حضور غلظت 2% از نشاسته طی 90 دقیقه است. میزان فعالیت آنزیم در این شرایطU/L 8222 می نتیجه گیری: این مقدار باالی فعالیت آنزیم تولید شده توسط باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 می تواند از نظر اقتصادی شایان توجه باشد. عالوه بر این توانایی فعالیت آن در دمای 50 درجه سانتی گراد و باالتر استفاده از آن را در فرآیندهایی که در دماهای باال انجام می شوند امکان پذیر می کند. شرایط ph بهینه 6 تا 7 جهت فعالیت باالی این آنزیم امکان استفاده در فرآیندهایی مثل مایع سازی و ژالتینه کردن نشاسته را ایجاد می کند. كلمات کلیدی: باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 کروماتوگرافی الیه نازک دی نیترو سالیسیلیک اسید α - آمیالز مقدمه آلفا-آمیالزها در واقع اندوآمیالزها هستند که هیدرولیز مهم آدرس نویسنده مسئول: گروه زيست فناوري صنعت و محيط زيست پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري )NIGEB( تهران ايران shariati@nigeb.ac.ir تاریخ دریافت مقاله: 1390/11/20 تاریخ پذیرش: 1391/02/31 و اولیه نشاسته به الیگوساکاریدهای کوتاه تر را از طریق شکست پیوندهای گلیکوزیدی آلفا- 1-Dو 4 کاتالیز می کنند. آلفا-آمیالزها توانایی عبور از روی پیوندهای آلفا- 1 و 6 را دارند و می توانند واحدهای گلوکز داخلی را هم آزاد کنند.

2 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم تابستان 1391 بررسی پروفیل آنزیمی... محصوالت حاصل از عمل آلفا-آمیالز الیگوساکاریدهایی با طول های متفاوت و کنفیگوراسیون α و دکسترین های آلفا- limit است که یک مخلوط از مالتوز مالتوتریوز و الیگوساکاریدهایی دارای 6-8 واحد گلوکز تشکیل می دهند )6(. آمیالزها یکی از اصلی ترین آنزیم های صنعتی هستند که حدود 25% از بازار جهانی آنزیم ها را به خود اختصاص می دهند. این آنزیم ها در صنایع مختلف مثل نساجی کاغذ سازی داروسازی و صنایع غذایی مانند شیرین سازی و فرآوری نشاسته استفاده می شوند )1 2(. تحقیقات بسیاری در ارتباط با کاربرد آنزیم های آمیلولیتیک تولید شده توسط اعضاء جنس باسیلوس در زمینه های مهم تولید قند آبجوسازی صنایع غذایی شوینده ها انجام شده است )4(. ویژگی های آلفا-آمیالزها مثل مقاومت نسبت به گرما و ph باید با کاربردهای آن متناسب باشد. بنابر این گستردگی کاربرد آنزیم ها موجب می شود که تحقیقات برای مشخص شدن ویژگی های آنزیم ها ادامه داشته باشد. نرخ هیدرولیز نشاسته توسط آلفا-آمیالز وابسته به شرایطی مثل دما ph منشا سوبسترا غلظت سوبسترا غلظت آنزیم وجود یا عدم وجود یون کلسیم و دیگر عوامل پایدارکننده آنزیم است )2(. آنزیم های مقاوم به گرما جهت استفاده در صنایعی که با دماهای باال همراه هستند بسیار مورد توجه می باشند. آنزیم های با گستره فعالیت در 6 ph تا 7 از نظر تجاری ترجیح داده می شوند )6(. به همین دلیل در این پژوهش بررسی روی پروفیل آنزیمی باکتری بومی و تعیین ویژگی های آن انجام شد. مواد و روش ها باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 از میکروارگانیسم هایی که طی تحقیقی با عنوان: جدا سازي و شناسايي يك سويه بومي باكتريايي مناسب مولد آنزيم هاي آميلولتيكي که توسط خانم دکتر پروین شریعتی در پژوهشگاه ملی ژنتیک و زیست فناوری انجام شده است انتخاب شد.طبق گزارشات پیشین این باکتری دارای فعالیت آمیلولیتیکی بسیار زیادی بوده است. محیط کشت اختصاصی تولید آنزیم آلفا-آمیالز K 2 14 گرم HPO 4 باکتری مورد نظر در محیط کشت حاوی KH 2 6 گرم در لیتر NaNo3 ۲ گرم در لیتر PO 4 در لیتر Trisodium citrate ۱ گرم در لیتر عصاره مخمر 5 گرم بر لیتر و نشاسته 10 گرم در لیتر کشت داده شد و هر 4 ساعت از آن نمونه برداری شد. نمونه ها تحت 5000 rpm و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و سوپرناتانت به عنوان محلولی که حاوی آنزیم بود جداسازی گردید. 1 کروماتوگرافی الیه نازک آنالیز متابولیت های حاصل از فعالیت آنزیم توسط کروماتوگرافی الیه نازک )TLC( انجام شد. ۱۵۰ ماكروليتر از سوپرناتانت حاوي آنزيم را با ۱۵۰ ماكروليتر از تركيب سديم فسفات 1/. موالر با 7 ph و نشاسته ۱ راباهم مخلوط شده و ویال حاوی این مواد را در دمای 50 درجه سانتی گراد و به مدت 5/1 ساعت انکوبه گشت و هر 30 دقیقه از آن نمونه برداری شد. سپس 1 ماکرو لیتر از نشانگر )حاوی گلوکز مالتوز مالتوتریوز مالتوتتراوز مالتوپنتاوز( و هر کدام از نمونه ها را با فاصله 2 سانتی متر از پایین ورقه TLC لکه گذاری شد )17(. تعیین وزن مولکولی آنزیم وزن مولکولی آلفا-آمیالز با استفاده از روش الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات PAGE( 2 )SDS تعیین شد. مالک تعیین وزن پروتئین ها در این روش یک نشانگر پروتئینی بود که از شرکت Fermentas تهیه شد )14(. زایموگرام بعد از انجام الکتروفورز ژل بوسیله تریتون 100-X 3 )v/v( 5% به مدت 15 دقیقه جهت حذف SDS شست و شو داده شد. سپس ژل محلول نشاسته 2% در فسفات بافر در 50 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. ژل در بافر فسفات در 50 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه شد و سپس بوسیله محلول لوگول )ید 0.3% در یدید پتاسیم 3%( به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی گردید. محل اثر آنزیم بر روی ژل به صورت یک لکه زرد رنگ مشخص گردید. عالوه بر این نمونه های ساعات مختلف نیز در ژل زایموگرام بررسی شد )14(. سنجش فعالیت آنزیم 1-Thin Layer Choromatography 2-Sodium dodecyl sulfate 3- Triton 42

3 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم الهام آریاپور و همکاران... جهت سنجش فعالیت آنزیمی از روش برند فلد که بر اساس استفاده از معرف دي نيترو ساليسيليك اسيد ( )DNS می باشد استفاده شد. ۱۵۰ ماكروليتر از سوپرناتانت حاوي آنزيم با ۱۵۰ ماكرو ليتر از تركيب سديم فسفات 1 /. موالر با ph 7 و سوبسترا ۱ مخلوط گردید و ویال حاوی این مواد در دمای ۳۷ درجه سانتي گرادو به مدت ۱ ساعت انکوبه شد پس از پایان این زمان ویال را بر روی یخ منتقل شده و به آن ۹۰۰ ماكروليتر معرف DNS اضافه گردید. سپس ۵ دقيقه در آب در حال جوش قرار داده شد. واكنش به وسيله قرار دادن ویال بر روي يخ متوقف شد و جذب آن ها به وسيله دستگاه اسپكتروفتومتر در طول موج ۵۵۰ نانومتر اندازه گیری گردید. مقدار آنزیمی که 1 میکروگرم مالتوز را طی 1 دقیقه از نشاسته ایجاد کند یک واحد آنزیمی گفته می شود. از مالتوز در رقت های 0/8 0/6 0/4 0/2 1 گرم بر لیتر جهت کشیدن نمودار استاندارد مالتوز استفاده گردید )2(. تعیین ویژگی های آنزیم آلفا-آمیالز تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم 150 ماکرولیتر از سوپرناتانت به همراه 150 ماکرولیتر از سوبسترای محلول )%1( در بافر فسفات با ph 7 به مدت 1 ساعت در دماهای و 60 درجه سانتی گراد انکوبه شد. و سپس توسط معرف DNS فعالیت آنزیم اندازه گیری شد. تعیین ph بهینه فعالیت آنزیم 150 ماکرولیتر از سوپرناتانت به همراه 150 ماکرولیتر از سوبسترا که در سیترات بافر )20 میلی موالر( با ph های 5 6/5 6 5/5 فسفات بافر 20( میلی موالر( با ph های 7/5 7 8 گالیسین NaOH بافر )20 میلی موالر( با ph های 9 8/5 9/5 و 10 به میزان %1 حل شده بود در 50 درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت انکوبه شد. سپس توسط معرف DNS فعالیت آنزیم اندازه گیری شد. تعیین زمان بهینه فعالیت آنزیم 150 ماکرولیتر از سوپرناتانت به همرا 150 ماکرولیتر از سوبسترا که در بافر با ph 7 به میزان %1 حل شده بود در 50 درجه سانتی گراد انکوبه شد. هر 30 دقیقه توسط معرف DNS فعالیت آنزیم اندازه گیری شد. تعیین درصد سوبسترا بهینه فعالیت آنزیم نشاسته با نسبت های /5 و 2/5 درصد در بافر با ph 7 حل شد. سپس 150 ماکرولیتر از سوپرناتانت به همراه 150 ماکرولیتر از سوبسترا در 50 درجه سانتی گراد به مدت 1/5 ساعت انکوبه شد. و سپس توسط معرف DNS فعالیت آنزیم اندازه گیری شد. یافته ها کروماتوگرافی الیه نازک پس از انجام کروماتوگرافی الیه نازک برای محصوالت حاصل از عملکرد آنزیم باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 روی نشاسته و مشاهده محل قرار گیری لکه ها و مقایسه آن ها با نمونه استاندارد مشخص شد که آنزیم تولید شده توسط این باکتری پس از تجزیه نشاسته مالتوپنتاوز مالتوتریوز مالتوز و با گذشت زمان بیشتری از انکوباسیون )90 دقیقه( مقادیر بسیار کمی گلوکز تولید کرده است. این یافته موید این مطلب بود که آنزیم مورد نظر از نوع آلفا-آمیالز است. نتیایج حاصل در شکل شماره 1 نمایش داده شده است. شکل 1- آنالیز متابولیت های حاصل از تجزیه نشاسته توسط آنزیم آلفا-آمیالز بوسیله كروماتوگرافي الیه نازک. تعیین وزن مولکولی آنزیم و زایموگرام فقط یک باند در ژل زایموگرام مشاهده شد و با توجه به این 43

4 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم تابستان 1391 بررسی پروفیل آنزیمی... که فقط آنزيم آلفا-آميالز توسط باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 توليد شده است وزن مولکولی اين آنزيم 55 کيلو دالتون تعيين شد )شکل 2(. آنزيم های توليدی در ساعات مختلف نيز در ژل زايموگرام بررسی شد که در همه ساعات فقط آنزيم آلفا-آميالز توليد می شد. در ساعت 4 توليد آنزيم ديده نمی شود و ساعت 16 زمان توليد بيشترين ميزان آنزيم است )شکل 3(. بااليی را دارد. ولی بهترين دما برای فعاليت آن 50 درجه سانتی گراد بود. در اين حالت ميزان فعاليت آنزيم 4384 U/L بود. نتايج بدست آمده در شکل شماره 4 نشان داده شده است. تعیین ph بهینه فعالیت آنزیم آلفا-آمیالز آنزيم آلفا-آميالز بدست آمده از باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 در محدوده 6/5 تا ph 8 توانايی فعاليت بااليی را داشت ولی بهترين ph برای فعاليت آن ph 7 بود. ميزان فعاليت آنزيم در اينpH U/L 4334 بود. نتايج حاصل در شکل 5 نمايش داده شده است. شکل 4- بررسی دمای مناسب فعاليت آلفا-آميالز شکل 5 - بررسی ph بهينه فعاليت آنزيم آلفا-آميالز ویژگی های آنزیم آلفا-آمیالز تعیین دمای بهینه فعالیت آنزی آلفا-آمیالز بررسی دمای مناسب جهت فعاليت آنزيم آلفا-آميالز توليد شده توسط باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 نشان داد که اين آنزيم در گستره دمايی درجه سانتی گراد فعاليت تعیین مدت زمان بهینه فعالیت آنزیم آلفا-آمیالز بررسی نتايج نشان داد که بيشينه فعاليت آنزيم آلفا-آميالز بدست آمده از باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH دقيقه پس از آغاز واکنش است. نتايج بدست آمده در شکل 6 آمده است.. ميزان فعاليت آنزيم در اين مدت زمان U/L 44

5 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم الهام آریاپور و همکاران گزارش شد. شکل 6 -نمودار تعيين مدت زمان بهينه فعاليت آنزيم آلفا-آميالز تعیین میزان بهینه سوبسترا فعالیت آنزیم آلفا-آمیالز نتايج نشان داد که بيشترين ميزان فعاليت آنزيم آلفا-آميالز بدست آمده از باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 در حضور مقدار 2 درصدی نشاسته است. همان طور که در شکل 7 مشاهده می شود ميزان فعاليت آنزيم در اين حالت U/L 8222 بوده است. شکل 7 - نمودار تعيين ميزان بهينه سوبسترا فعاليت آنزيم بحث باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس قسمت عمده توليد جهانی آلفا-آميالز را به خود اختصاص داده است )12(. آلفا-آميالز حاصل از اين باکتری در صنايع مختلف مخصوصا صنايع غذايی استفاده می شود. آلفا-آميالز بدست آمده از باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 اولين آنزيمی بود که در مقياس صنعتی برای مايع سازی و شيرين سازی نشاسته استفاده شد )10(. به دليل اهميت آلفا-آميالزها در بخش صنعتی و اختصاص دادن 15 تا 20 درصد بازارهای جهان در بخش شيرين سازی به خود و همچنين اهميت سويه های بومی برای توليد اين آنزيم ها اين پژوهش با هدف بررسی سويه بومی با توانايی توليد ميزان باالی آنزيم آلفا -آميالز انجام شد به گونه ای که بتوان از آن در صنعت استفاده کرد. برای اين منظور با استفاده از روش های PAGE Native PAGE TLC پروفايل آنزيمی باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 تعيين شد. پس از انجام کروماتوگرافی اليه نازک برای محصوالت حاصل از عملکرد آنزيم باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 روی نشاسته و مشاهده محل قرار گيری لکه ها و مقايسه آن ها با نمونه استاندارد مشخص شد که آنزيم توليد شده توسط اين باکتری پس از تجزيه نشاسته مالتوپنتاوز مالتوتريوز مالتوز و با گذشت زمان بيشتری از انکوباسيون )90 دقيقه( مقادير بسيار کمی گلوکز توليد کرده است. اين موضوع تاييد می کند که آنزيم مورد نظر از نوع آلفا-آميالز است. الگوی کروماتوگرافی اليه نازک در تحقيقاتی که توسط محققين ديگر )2 8(. 7 انجام شده نيز نشان دهنده توليد متابوليت های مالتوز مالتوتريوز مالتوتتراوز و مقدار بسيار کمی گلوکز از نشاسته توسط آنزيم آلفا-آميالز می باشد. در ژل زايموگرام فقط يك هاله ديده شد پس باکتری باسيلوس آميلوليکوئيفاسينس BEH 111 فقط قادر به توليد آنزيم آلفا-آميالز است. عالوه براين نمونه های بدست آمده از ساعات مختلف کشت نيز فقط در يك باند قرار گرفته و وزن مولکولی همه آن ها نيز يکسان بود. بنابر اين اين باکتری در تمام طول مدت انکوباسيون فقط يك نوع آنزيم که همان آلفا-آميالز است توليد می کند. با توجه به شدت هاله های ايجاد شده مشخص است بيشينه ميزان توليد آنزيم آلفا-آميالز 16 ساعت پس از انکوباسيون اتفاق می افتد. ازمقايسه ژل های SDS-PAG و زايموگرام نيز مشخص شد که وزن اين آلفا-آميالز 55 کيلو دالتون است. وزن 45

6 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم تابستان 1391 بررسی پروفیل آنزیمی... مولکولی آلفا-آمیالزهای حاصل از باسیلوس ها بسیار متفاوت است. در جدول شماره 1 وزن مولکولی آلفا-آمیالز حاصل از باکتری باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 با چند جنس و گونه دیگر مقایسه شده است )6 ( گستردگی کاربرد آنزیم ها موجب می شود که تحقیقات زیادی برای مشخص شدن ویژگی های آن ها انجام شودنرخ هیدرولیز نشاسته توسط آلفا-آمیالز وابسته به شرایطی مثل دما ph منشا سوبسترا غلظت سوبسترا غلظت آنزیم وجود یا عدم وجود یون کلسیم و دیگر عوامل پایدارکننده آنزیم است. در سال 1992 تحقیقاتی روی Archaebacterium Natronococcus sp انجام شد. آمیالز تولیدی آن خالص سازی شد و وزن مولکولی این آنزیم 74 کیلودالتون اعالم گردید. بیشینه فعالیت آمیالز در دمای 55 درجه سانتی گراد و 8/7 ph در کلرید سدیم 2/5 موالر بود. آمیالز بدست آمده در گستره - 8/6 6 ph دمای 50 درجه سانتی گراد پایداری خود را حفظ می کرد )11(. همچنین در سال 1995 آنزیم آلفا-آمیالز تولید شده توسط Bacillus GM8901 که یک باکتری قلیادوست است را خالص سازی و ویژگی های آن را تعیین کردند. این باکتری پنج آمیالز قلیایی را در دمای 50 درجه سانتیگراد و 10/5 ph تولید می کرد. یکی از این آمیالزها خالص سازی شد و وزن مولکولی آن 97 کیلودالتون اعالم گردید. بیشینه فعالیت آن آنزیم در ph 11 تا 12 بود و پایداری خود را در گستره 13 تا ph 6 حفظ می کرده است. پایداری دمایی آن در حضور 2+ Ca افزایش پیدا می کرده است ) 10 (.در تحقیقی که بر روی آلفا-آمیالز حاصل از Bacillus SP.marini در سال 2011 انجام شد مشخص شد بهینه فعالیت این آنزیم در 40 درجه سانتیگراد 7 و ph حضور نشاسته به میزان %1 می باشد )3(. آلفا-آمیالز بدست آمده از Bacillus subtilis نیز در دمای درجه سانتی گراد 7pH و حضور نشاسته به میزان %1 بیشینه فعالیت خود را نشان داد )11(. وزن مولکولی آنزیم آلفا-آمیالز حاصل از Bacillus amyloliquifaciencetswk کیلو دالتون گزارش شد. دما و ph بهینه جهت فعالیت این آنزیم آلفا-آمیالز به ترتیب 70 درجه سانتی گراد و 7 بود. عالوه بر این این آنزیم از انواع آلفا-آمیالزهای غیر وابسته به کلسیم بود )2(. همانگونه که مشخص است آلفا-آمیالزها با توجه به منبع تولید خود دارای ویژگی های بسیار متفاوتی هستند.در این تحقیق اثر دما ph غلظت سوبسترا و مدت زمان واکنش بر میزان فعالیت آنزیم آلفا-آمیالز بررسی شد. و مشخص شد که بیشینه فعالیت در دمای 50 درجه سانتی گراد ph مناسب 7 بهترین غلظت سوبسترا %2 و بهترین زمان جهت واکنش 90 دقیقه است. جدول 1 - مقایسه وزن مولکولی آلفا-آمیالز حاصل از باکتری باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 با چند جنس و گونه دیگر. وزن مولکولی نام باکتری )KDa( Bacillus amyloliquifaciencetswk Geobacillus species 52 Bacillus sp. HUTBS Bacillus licheniformis 100 Alicyclobacillusacidocaldarius 94 Bacillus sp. US نتیجه گیری از آنجا که زمینه کاربرد آلفا-آمیالزها با توجه به ویژگی های آن ها بسیار گسترده است تعیین ویژگی ها و خصوصیات این دسته از آنزیم ها می تواند در انتخاب صحیح و استفاده از آن ها بسیار موثر باشد. آلفا-آمیالزهایی که در گستره دمایی باال و ph 6-7 فعالیت دارند از نظر تجاری برای واکنش هایی که در دمای باال انجام می شوند مورد توجه هستند. استفاده از این آنزیم ها موجب کاهش زمان و هزینه در طی انجام این گونه فرآیندها می شود. میزان باالی فعالیت آنزیم تولید شده توسط باسیلوس آمیلولیکوئیفاسینس BEH 111 می تواند از نظر اقتصادی شایان توجه باشد. عالوه بر این توانایی فعالیت آن در دمای 50 درجه سانتی گراد و باالتر استفاده از آن را در فرآیندهایی که در دماهای باال انجام می شوند امکان پذیر می کند. همچنین شرایط ph بهینه 6 تا 7 جهت فعالیت باالی این آنزیم امکان استفاده در فرآیندهایی مثل مایع سازی و ژالتینه کردن نشاسته را ایجاد می کند. 46

7 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم الهام آریاپور و همکاران... تشکر و قدردانی بدینوسیله از همه همکاران محترم پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری و معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسالمی واحد فالورجان در خصوص در اختیار گذاشتن فضای تحقیقاتی کمال تشکر را داریم. 47

8 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره دوم شماره هفتم تابستان 1391 بررسی پروفیل آنزیمی... منابع (1) Aiyer PV. Amylases and Their Applications.African Journal of Biotechnology, 2005;4: (2) Annamala N, Thavasi R, Vijayalakshmi S, Balasubramanian T. Extraction, Purification and Characterization ofthermostable,alkaline Tolerant a-amylase from Bacillus cereus. Indian J Microbiol, 2011; 43: (3) Ashwini K, Gaurav Kumar, Karthik L, BhaskaraRao K.V. Optimization, Production and Partial Purification of Extracellular a-amylase from Bacillus sp. Marini.Archives of Applied Science Research, 2011; 3: (4) Bano S, Qader A, Aman A, Syed M, Azhar A. Purification and Characterization of Novel-Amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech, 2011; 12: (5) GangadharanD,RamachandranP,Paramasamy, Gunasekaran P, Ashok N.. a-amylase Production by Bacillus amyloliquefaciens Using Agro Wastes as Feed Stock. Food Technol Biotechnol, 2010; 49: (6) GhollasiMarzieh. KhageKhosro.Naderi-ManeshHossein.GhasemiAtiyeh. Engineering of a Bacillus-Amylase with Improved Thermostability and Calcium Independency.ApplBiochemBiotechnol, 2010; 162 : (7) HmidetNoomen. HaddarAnissa.NasriMoncef. A Novel-Amylase from Bacillus mojavensis A21: Purification and BiochemicalCharacterization. ApplBiochemBiotechnol, 2010; 162: (8) Joshi BH. A Novel Thermostable Alkaline a-amylase from Bacillus circulans PN5: Biochemical Characterization and Production. Asian Journal of Biotechnology, 2010; 3: (9) Kikani BA.Singh PS. Single Step Purification and Characterization of A Thermostable and Calcium independent alpha-amylase from Bacillus amyloliquifaciens TSWK1-1 isolated from TulsiShyam hot spring reservoir, Gujarat (India). International Journal of Biological Macromolecules, 2011; 48: (10) Kim T U, Bu G, Jay Y J, Si M B, Yong C S. Purification and Characterization of a Maltotetraose-Forming Alkaline a-amylase from an Alkalophilic Bacillus Strain, GM8901. Applied and Enviromental Microbiology, 1995; 61: (11) Kobayashi T, Kanai H, Hayashi T, Akiba T, Akaboshi R, Horikoshi K. Haloalkaliphilic Maltotriose-Forming ox- Amylase From the Archaebacterium Natronococcus sp. Strain Ah-36. Journal of Bacteriology, 1992; 174: (12) Manas R. Swain. ShaktimayKar.GourikuttiPadaja. Ramesh Ray. Parchial Characterization and Optimization of Production of Exteracellular Amylase from Bacillus Subtilis Isolated from Culturable Cow Dung Microbiology. Polish Journal of Microbiology, 2006 ; 55: (13) Priest F G, Godfellowl M, ShuteL A, Berkeley R C W.. Bacillus amyloliquefaciens sp. nov. norn. rev. International Journal of Systematic Bacteriol, 1987; 37: (14) SaeedaBano. AfsheenAman.Muhammad NomanSyed.AbidAzhar. Purification and Characterization of Novel Amylase from Bacillus Subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech, 2011; 12: (15) Saxena R K, Dutt K, Agarwal L, Nayyar P. A Highly Thermostable and Alkaline Amylase from a Bacillus sp. PN5. Bioresource Technology, 2006; 98: (16) SivaramakrishnanSwetha. NampoothiriKesavanMadhavan.Soccol Carlos Ricardo. Pandey Ashok. a-amylases from Microbial Sources An Overview on Recent Developments. Food Technol Biotechnol, 2006;44: (17) Zhao Wei ZJ. Wang Yu-guang. Zhou Hong-bo. A Marked Enhancement in Production of Amylase by Bacillus Amyloliquefaciens in Flask Fermentation Using Statistical methods J Cent.South Univ Technol, 2011;12: